在大鼠ELISA實驗中，終止液（通常為2mol/L H?SO?）的作用是通過強酸性環(huán)境破壞辣根過氧化物酶（HRP）的活性，從而立即停止TMB底物的顯色反應(yīng)。若漏加終止液，酶促反應(yīng)將繼續(xù)，藍色會持續(xù)加深，吸光度（OD值）不斷上升，嚴重影響定量準確性。
常見錯誤與注意事項：
不能跳過終止步驟：有文獻指出部分ELISA可在不加終止液的情況下直接讀數(shù)，但這需嚴格控制時間且波長不同（終止前~650nm，終止后~450nm），常規(guī)檢測必須加終止液以穩(wěn)定顏色并轉(zhuǎn)換至標(biāo)準波長。
洗板無法替代終止：洗滌只能去除游離成分，不能滅活已結(jié)合的HRP酶，反應(yīng)仍會繼續(xù)。
安全操作：補加時避免產(chǎn)生氣泡，使用一次性吸頭防止交叉污染。
漏加終止液的影響與補救策略
影響階段 | 是否可補救 | 補救方法 |
剛發(fā)現(xiàn)漏加，顯色仍在進行中 | ? 可補救 | 立即每孔加入50μl終止液，混勻后馬上測定OD值（450nm） |
已超過推薦讀數(shù)時間（如>15分鐘），但顏色未明顯褪去 | 部分有效 | 補加終止液后立即讀數(shù)，并在結(jié)果分析時注明“延遲終止"，謹慎解讀 |
顯色已長時間未終止，TMB可能已降解或沉淀 | ? 難以補救 | 數(shù)據(jù)不可靠，建議重做實驗 |
建議
立即行動：一旦發(fā)現(xiàn)漏加，應(yīng)第一時間補加終止液并讀數(shù)。
記錄異常：在實驗記錄中標(biāo)明“漏加終止液，于XX分鐘后補加"，便于后續(xù)數(shù)據(jù)分析和復(fù)現(xiàn)實驗。
預(yù)防為主：使用標(biāo)準化操作流程（SOP）或排槍配合多通道移液器，減少人為失誤。
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